Deteksi Virus Patogen dengan Metode PCR

Metode deteksi virus umumnya menggunakan metode teknik Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) dan reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). ELISA didasarkan pada penggunaan antibodi yang didapatkan dari hewan untuk mengenali protein virus. Metode ini telah lama digunakan untuk pengujian virus tanaman karena kemudahan dan sensitivitasnya yang cukup baik. Meskipun demikian metode ini mempunyai kelemahan yaitu, kemungkinan terjadinya reaksi silang dengan protein tanaman (Webster et al. 2004). Teknik RT-PCR didasarkan pada pendeteksian RNA virus. Teknik ini memiliki keunggulan dibandingkan dengan ELISA karena memiliki spesifitas dan sensitivitas yang lebih baik (Henson & French 1993). Namun  di balik keunggulannya metode RT-PCR juga memiliki beberapa kekurangan diantaranya adalah keberadaan senyawa inhibitor pada ekstrak RNA total tanaman yang dapat mempengaruhi proses amplifikasi DNA target (Narayanasamy 2008).

Selain teknik RT-PCR dan Elisa deteksi virus pathogen juga dapat dilakukan dengan Teknik sintesis dan amplifikasi fragmen DNA secara in vitro yang dikenal dengan Polymerase chain reaction (PCR) merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi penyakit infeksi yang baru-baru ini banyak dikembangkan. Metode ini digunakan untuk mengatasi kelemahan metode diagnosis konvensional seperti imunologi dan mikrobiologi. Patogen memiliki waktu generasi lama dan tidak dapat dibiakkan secara in vitro atau patogen yang mirip dengan flora normal sulit untuk dideteksi dengan cara mikrobiologi biasa. Sedangkan titer antibodi tinggi tidak selamanya berbanding lurus dengan adanya infeksi aktif (Retnoningrum 1997). Oleh karena itu perlu dilakukan deteksi virus penting yang mungkin menyerang tanaman dengan metode PCR.

Virus patogen benih cabe yang akan dideteksi dalam praktikum ini adalah kelompok begomo virus. Praktikum Patologi Benih acara 4 dengan judul Deteksi Virus Patogen dengan Metode PCR ini dilaksanakan pada tanggal 14-28 November 2012 di Laboratorium Klinik Tumbuhan, Ilmu Hama da Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Alat yang digunakan adalah Cawan petri,  Erlenmeyer, dan L-glass. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan antara lain sampel daun dari tanaman yang bergejala begomo virus, nitrogen cair, chloroform, etanol, isopropanol, dan Phytopure DNA extraction kit. Langkahnya terdiri dari tiga tahap, yaitu ekstraksi DNA total, PCR, kemudian visualisasi hasil PCR. Sintesis cDNA hanyadiperlukan jika virus patogen yang dicari asam nukleatnya berupa RNA. Sedangkan pada praktikum ini virus yang dicari adalah dari jenis begomo virus yang asam nukleatnya berupa DNA. 

Metode ekstraksi DNA dilakukan dengan cara sebagai berikut: Sampel jaringan daun yang telah dicuci dengan chloroform 0,1 g ditambah 600 µl reagent₁. Kemudian ditambah 200 µl reagent₂ dan dikocok bolak-balik. Campuran sampel tersebut diinkubasi 65ºC selama 10 menit dalam water bath, setelah itu disimpan di dalam es selama 20 menit (di luar freezer). Sembari menunggu, 500 µl kloroform yang disimpan dalam suhu -20ºC ditambahkan 100 µl nucleon phytopure DNA, divortex selama 10 menit, disentrifuge 1300g (4300rpm) 10 menit, setelah itu lapisan bagian atas sampel yang sudah terpisah dipindahkan ke tube baru. Setelah dipindahkan, sampel ditambah isopropanol dingin (divortex sampai bercampur), disentrifuge pada 4000g (12000rpm) 15 menit, lalu cairan dibuang dan dan endapan yang dihasilkan ditambah 70% etanol dingin, disentrifuge pada 4000g (12000rpm) 5 menit, lalu cairan dibuang kembali dan keringkan hingga. Setelah DNA hasil ekstraksi benar-benar kering, kemudian disuspensikan dengan TE Buffer.

Bahan-bahan yang digunakan untuk proses PCR yaitu MMR 7,5µl, Primer ₁ 0,6 µl, Primer ₂ 0,6 µl, ddH₂O 9 µl, dan DNA hasil ekstraksi sebanyak 1 µl. Proses amplifikasi DNA dalam PCR melalui empat tahapan siklus thermal, yaitu denaturasi 65ºC selama 10 menit, annealing 50ºC selama 60 menit, ekstensi 85ºC selama 5 menit, dan ekstensi akhir 4ºC.

Hasil amplifikasi kemudian divisualisasi menggunakan gel agarosa konsentrasi 1,5% dalam bufer TAE, menggunakan voltase 75 volt selama 65 menit, dan direndam dalam etidium bromida konsentrasi 10% selama 30 menit.

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Gejala Tanaman Terserang Begomovirus yaitu helai daun tampak kuning (vein clearing), tulang daun menebal, helai daun menggulung ke atas (cupping), pada gejala lanjut daun-daun muda menjadi kecil-kecil dan tanaman menjadi kerdil. 

Gambar 1. Tanaman cabe bergejala begomo virus

Secara umum, teknik PCR ini didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik di mana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Teknik ini sangat ideal untuk mengidentifikasi patogen dengan cepat dan akurat. Secara umum proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap yang berurutan yaitu denaturasi templat, annealing (penempelan) pasangan primer pada untai tunggal DNA target dan extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi DNA antara 106-109 kali (Watson et al, 1992). Tujuan dari PCR ini adalah agar genom dari DNA sampel dapat teridentifikasi pada proses selanjutnya. Dalam praktikum ini setelah PCR kemudian DNA di-running dengan metode elektroforesis gel agarose.

Pada saat elektroforesis, molekul-molekul DNA dipisahkan berdasarkan tingkat migrasinya dalam medan listrik. DNA yang bermuatan negatif dilewatkan dalam medium gel agarose fase diam, kemudian dialiri arus listrik. Molekul DNA tersebut bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerakan molekul-molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massa molekulnya, serta bentuk molekulnya berdasarkan gaya Lorentz. Dengan demikian, hasil dari elektroforesis ini adalah fragmen-fragmen DNA murni. Titik terjauh migrasi dari DNA yang di running mengindikasikan banyaknya pasangan basa penyusunnya. Sehingga bila jarak migrasi sampel DNA yang diidentifikasi tidak sama dengan jarak migrasi marker berarti tidak terdapat patogen yang dicari pada sampel tersebut. Demikian pula sebaliknya jika jarak migrasi sampel DNA sama dengan marker maka berarti terdapat patogen yang dicari dalam sampel.

 

Gambar 2. Visualisasi hasil PCR dengan gel elektroforesis

Meskipun tanaman tampak bergejala begomo virus, namun visualisasi hasil PCR dengan gel elektroforesis menunjukkan tidak adanya gejala virus tersebut. Jarak migrasi sampel DNA tidak sesuai dengan markernya. Sehingga ada kemungkinan virus yang menyerang tanaman cabe tersebut bukan begomo virus. Hasil elektroforesis yang tidak bersih menunjukkan bahwa ekstraksi DNA sebenarnya belum tuntas. Untuk mendapatkan hasil yang akurat sebaiknya dilakukan ekstraksi DNA dan PCR ulang.

KESIMPULAN

Prinsip dasar teknik PCR adalah amplifikasi fragmen DNA spesifik dalam waktu yang relatif singkat. Tujuannya adalah agar genom dari DNA sampel dapat teridentifikasi pada proses selanjutnya. Dalam praktikum ini, setelah PCR kemudian DNA di-running dengan metode elektroforesis gel agarose. Dengan teknik PCR ini tidak terdeteksi adanya begomo virus pada tanaman cabe sampel yang digunakan.

Download file .doc 

DAFTAR PUSTAKA

Watson, J.D., Gilman, M., Witkowski, J. & Zaller, M. 1992. Recombinant DNA. New York: WH Freeman.

Webster C G, Wylie1 S J, Jones M G K. 2004. Diagnosis of plant viral pathogens. Current Science 12:1604-1607.

Henson M J, French R. 1993. The polymerase chain reaction and plant disease diagnosis. Annu. Rev. Phytopathol. 31: 81-109. 

Narayanasamy P. 2008. Molecular Biology in Plant Pathogenesis and Disease Management. Coimbatore: Springer.

Retnoningrum, D.S. 1997. Penerapan Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk diagnosis penyakit infeksi. Jurusan Farmasi FMIPA. Bandung: ITB.