Deteksi Virus Patogen dengan Metode LAMP

Produksi budidaya tanaman dalam bidang pertanian dapat bernilai tinggi baik secara kualitas maupun kuantitas apabila faktor-faktor yang mempengaruhi produksi tersebut dilakukan secara baik. Salah satu faktor yang mempengaruhi produksi pertanian adalah Benih tanaman. Benih yang bermutu rendah, baik dalam hal daya tumbuh maupun karena terinfeksi patogen tular benih, apabila ditanam akan menghasilkan populasi tanaman per satuan berat benih dan luas tanam yang lebih rendah dibanding benih yang bermutu tinggi. Populasi tanaman yang tumbuh dan dipanenmerupakan faktor yangmenentukan tinggi rendahnya produksi dan produktivitas tanaman.  Rendahnya populasi tanaman antara lain disebabkan oleh daya tumbuh benih yang rendah, atau oleh serangan hama dan penyakit. Benih yang tidak sehat (terinfeksi oleh patogen) akan tumbuh menjadi kecambah dan tanaman yang juga tidak sehat, sehingga tidak mampu berproduksi optimal. Infeksi patogen tular benih tersebut seringkali tidak nampak jelas pada benih dan barumemperlihatkan gejala pada kecambah, bahkan adakalanya baru tampak pada saat tanaman sudah tumbuh dewasa (Saleh, 2008).

Salah satu patogen benih yang berpotensi merugikan adalah virus. Penyakit mosaik pada tanaman cabai umumnya disebabkan oleh gabungan beberapa patogen virus. TMV merupakan virus yang diketahui dapat ditularkan melalui benih (Widodo dan Wiyono, 1995). Tanaman yang terserang TMV menurut Widodo dan Wiyono, menunjukkan gejala, yaitu daun-daun muda berubah menjadi warna belang kuning hijau, keriting serta berkerut, tanaman kerdil, buah belang dan berwarna kuning, serta munculnya garis nekrosis pada daun cabai yang menyebabkan terjadinya gugur daun.

Untuk mendeteksi virus yang terdapat dalam benih maka harus dilakukan prosedur-prosedur tertentu, Karena ukuran virus sangat kecil, menyebabkan virus sulit dideteksi. Ada sejumlah teknik yang biasanya digunakan untuk identifikasi awal virus, yaitu (Burgess, 1955):

1.      Menggunakan mikroskop elektron untuk memvisualisasi virus di dalam sel-sel jaringan.

2.      Menumbuhkan virus di laboratorium menggunakan cell line, yaitu melakukan kultur sel jaringan di laboratorium (in vitro).

3.      Identifikasi virus menggunakan teknik serologi, menggunakan serum dari inang yang mengandung antibodi spesifik terhadap virus tertentu. Dengan demikian manakala virus (sebagai antigen) kontak dengan serum akan terjadi aglutinasi sebagai respon antibodi terhadap antigen.

4.      Menggunakan PCR dan sequencing DNA.

5.      Secara imunokimia/imunositokimia.

Selain itu, terdapat juga metode modern yang sering disebut dengan metpde LAMP. Metode deteksi virus patogen dengan metode Loop mediated isothermal amplification (LAMP)  merupakan teknik tabung tunggal untuk amplifikasi DNA. Amplifikasi dan deteksi gen dengan LAMP (Anonim, 2005) dapat diselesaikan dalam satu langkah, yaitu dengan menginkubasi campuran sampel DNA, primer, dan DNA polimerase pada suhu konstan (sekitar 65 ° C) selama 15-60 menit. Deteksi secara visual dapat dilakukan dengan bantuan flourecence.

Praktikum Patologi Benih acara kelima dengan judul Deteksi Virus Patogen dengan Metode Lamp ini dilaksanakan pada tanggal 26 November 2012 di Laboratorium Klinik Tumbuhan, Ilmu Hama da Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta. Alat yang digunakan adalah tusuk gigi steril, Water bath, dan Kotak UV. Sedangkan bahan-bahan yang digunakan adalah tanaman hasil growing on test dan Kit LAMP. Master mix dibuat dari campuran RM 6,25 µL, FIP 0,4 µL, BIP 0,4 µL, Loop 0,2 µL, F3 0,5 µL, B3 0,5 µl, Flouresence dye 0,5 µL, EM 0,5 µL, dan DW 3,25 µL.

Cara kerja dalam  praktikum  ini dengan terlebih dahulu menyiapkan sampel yakni daun diambil  menggunakan plastik kemudian ditusuk dengan tusuk gigi hingga terambil cairan selnya berwarna kehijauan. Setelah itu sampel dimasukkan ke master mix satu per satu. Saat perlakuan diusahakan tidak terkontaminasi antara perlakuan satu dengan lainnya. Kemudian dilakukan inkubasi 62º C selama 1 jam, 100ºC selama 1 menit, dan 85º C selama 4 menit.

  

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Metode LAMP termasuk metode yang modern sebagai alternatif deteksi karena biaya yang rendah untuk mendeteksi suatu penyakit tertentu. LAMP adalah pendekatan baru untuk amplifikasi asam nukleat yang menggunakan suhu inkubasi tunggal sehingga menghindarkan kebutuhan untuk cyclers termal yang mahal.

Deteksi produk amplifikasi dapat menggunakan fotometri untuk kekeruhan yang disebabkan oleh peningkatan kuantitas pirofosfat Magnesium dalam larutan atau dengan penambahan SYBR hijau, perubahan warna dapat dilihat tanpa peralatan yang canggih. Tabung deteksi amplifikasi DNA Juga dimungkinkan untuk menggunakan manganes yang mengandung calcein yang mulai fluorescing manganes pada kompleksasi oleh pirofosfat selama dalam sintesis DNA in vitro (Anonim, 2011).

Jenis virus yang dilaporkan dapat menginfeksi tanaman cabai di Indonesia di antaranya adalah Cucumber Mozaik Virus (CMV). CMV memiliki daerah menyebaran yang cukup luas dan selalu ditemukan pada setiap pertanaman cabe yang diamati, walaupun porsinya berbeda-beda. CMV sering kali menginfeksi secara bersama-sama dengan ChiMV (Chili Veinal Mottle Virus). Gejala yang muncul pada tanaman berbeda-beda antar varietas, yang pada dasarnya terjadi gangguan dalam proses pertumbuhan tinggi tanaman.

Gambar 1 dan 2. Tanaman hasil growing on test yang diuji dengan LAMP (kiri) dan pengambilan cairan selnya (kanan)

Meskipun LAMP mudah untuk dilakukan namun dalam pelaksanaannya jika tidak hati-hati maka dapat terjadi kesalahan yang menyebabkan kegagalan deteksi. Dalam praktikum ini, patogen tidak dapat terdeteksi karena saat inkubasi tube kemasukan air dari water bath. Air yang masuk ke dalam tube menyebabkan terjadinya pengenceran berlebih pada sampel.

Pada dasarnya untuk dapat mendeteksi adanya patogen Cucumber Mozaic Virus dalam sampel, genom virus yang sesuai dengan primer penciri Cucumber Mozaic Virus diamplifikasi secara terus menerus. Proses selama inkubasi dalam LAMP sebenarnya tidak jauh berbeda dengan PCR, proses LAMP menjadi lebih sederhana dan cepat karena amplifikasi terjadi secara cepat melalui pembentukan pin atau cincin. Apabila tidak terdapat genom yang dimaksud, maka tidak akan terjadi amplifikasi dan hasil visualisasi di bawah sinar UV akan negatif. Terjadinya pengenceran pada sampel bisa jadi menggagalkan proses amplifikasi.

KESIMPULAN

LAMP adalah pendekatan untuk amplifikasi asam nukleat yang menggunakan suhu inkubasi tunggal. Deteksi patogen dengan metode ini dapat menjadi lebih cepat dan murah. Tidak dapat dilakukan deteksi pada sampel tanaman yang digunakan karena pada saat inkubasi, mikrotube kemasukan air.

Download file .doc 

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2005. LAMP standard procedures. < http://loopamp.eiken.co.jp/e/tech/index.html>. Diakses 19 Oktober 2012.

Anonim. 2011. Loop-mediated isothermal amplification. < http://en.wikipedia.org/wiki/Loop-mediated_isothermal_amplification>. Diakses tanggal 18 Desember 2012.   

Burgess, G. W. 1995. Teknologi Elisa dalam Diagnosis dan Penelitian. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.
Saleh, N. 2008. Penggunaan Benih Sehat sebagai Sarana Utama Optimasi Pencapaian Produktivitas Kedelai. Iptek Tanaman Pangan 3: 229-243.
Widodo., S. Wiyono. 1995. Agrotek. Wahana Informasi dan Alih Teknologi Pertanian. 2: 70-72.