Deteksi Bakteri Patogen Benih Cabe Keriting (Capsicum Annum)

Diagnosis penyakit yang disebabkan bakteri dan identifikasi bakteri penyebabnya terutama didasarkan pada gejala penyakit, terdapatnya bakteri dalam jumlah besar secara terus menerus pada daerah terserang, dan tidak terdapat patogen lain di tempat tersebut. Telah tersedia medium selektif untuk pemeliharaan secara selektif untuk hampir semua jenis bakteri patogenik tumbuhan yang bebas dari saprofit umum, sehingga dapat diidentifikasi sampai tingkat genus bahkan sampai tingkat spesies (Agrios, 1996).

Kesehatan benih terutama ditujukan pada ada atau tidaknya penyakit yang disebabkan oleh organisme, seperti jamur, bakteri dan virus dan hama, seperti ulat dan serangga tetapi kondisi fisiologi juga dapat menjadi penyebabnya. Pengujian mengenai ada atau tidaknya organisme terbawa benih harus dilakukan dengan metode yang berdasarkan pada penelitian yang dapat diterima secara internasional (Mathur et al., 2003). 
Pseudomonas syringae adalah bakteri gram negatif, aerobik, berbentuk batang, dan memiliki flagela polar. Secara biokimia, bakteri ini dapat diuji dengan menggunakan uji oksidase dan arginin hidrosilase yang akan menunjukkan hasil negatif. P. syringae merupakan mikroorganisme yang terdapat dalam setiap kubik udara (40 mikroorganisme/ kubik) dan memiliki 58-60% GC (guanin-sitosin). P. syringae dapat ditemukan pada tanaman, tanah, dan udara, tapi umumnya memiliki habitat pada permukaan daun berbagai tanaman sehingga termasuk bakteri filosfer dan merupakan patogen pada beberapa spesies tanaman tertentu (Sundin et al., 1994).

Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidoglikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin) (Buck, 1982). 
Uji patogenisitas dilakukan pada bibit jagung rentan (varietas  Arjuna)  berumur 8 hari. Batang diinokulasi dengan suspensi bakteri 10⁸ CFU/ml. Pengukuran kerapatan sel bakteri dalam suspensi menggunakan metode turbidimetrik dengan bantuan spektofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Gejala water soaking akan muncul setelah 3 hari  dan tanaman akan layu antara 5-8 hari setelah inokulasi. Inokulasi bakteri dilakukan sampai pada pembuluh xylem terutama pada bagian petiole, batang atau akar. Hasil pengujian reaksi hipersensitif pada daun tembakau dari isolat Pnss  memperlihatkan bahwa gejala nekrotik muncul 2 x 24 jam, dimana gejala awal ditandai dengan adanya bercak kebasah-basahan (water soaking), sedangkan dari uji patogenisitas yang menggunakan varitas jagung rentan, gejala pada daun  muncul pada hari ke 7 (Rahma dan Khairul, 2009).

Ketika bakteri hidup disuntikan ke dalam mesofil daun dari tanaman yang tidak sesuai pada konsentrasi sekitar 10⁸ cell/ml, nekrotik dengan cepat berkembang dan saling bertemu dalam waktu 8-12 jam setelah inokulasi. Respon yang cepat ini disebut dengan   Hypersensitive reaction (HR). Kekhasan dari HR (Hypersensitive reaction) biasanya disebabkan oleh bakteri hidup. Prosesnya terdiri dari 3 tingkatan : 3-4 jam waktu induksi, 4-5 jam periode latent, dan 1-2 jam periode runtuhnya jaringan (Goto, 19992).Praktikum Acara III dengan judul Deteksi Bakteri Patogen Benih Cabe Keriting (Capsicum annum var Longum) ini dilaksanakan pada tanggal 24-30 Oktober 2012 di Laboratorium Klinik Tumbuhan, Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada. Alat dan bahan yang digunakan adalah cawan petri, benih cabe keriting (Capsicum annum var Longum), dan PDA (Potato Dextrose Agar).

Pada praktikum ini, terdapat 2 tahap, yang pertama adalah tahap suspensi, kemudian tahap pengenceran. Pengamatan dilakukan setelah masa inkubasi 48 jam. Lalu di uji hipersensitif dengan disuntikkan suspensi hasil pengenceran (10^-3) ke daun tanaman tembakau. Untuk tahap pertama, yaitu tahap suspensi, pertama dilakukan perendaman 1000 biji cabe keriting (Capsicum annum) dengan 59,69 ml air, kemudian digojok selama 30 menit dan diinkubasikan selama 24 jam. Setelah inkubasi selesai, didapatkan suspensi bakteri yang kemudian diencerkan sampai 10^-5 (5 x pengenceran).  Setelah diencerkan sebanyak 5x pengenceran, di ambil sebanyak 1 ml pada pengenceran 10^-3-10^-5 dan dituangkan kedalam medium PDA, diratakan dengan L-glass. Setelah itu diinkubasikan selama 2x24 jam, dan amati pertumbuhan koloni bakteri setelah diinkubasi. Lalu di pindahkan ke agar miring isolat bakteri tersebut.

Langkah kerja berikut adalah uji Hipersensitif. Pada langkah uji pertama, isolat bakteri dari benih cabe (Capsicum annum) diperoleh dari seri pengenceran 10^-3, 10^-4, dan 10^-5. Masing-masing isolat dibuat suspensi bakteri dengan menambahkan air steril. Dengan alat suntik tanpa jarum, suspensi bakteri diambil kemudian diinfitrasikan ke dalam lamina daun tanaman indikator (tembakau) melaui permukaan bawah daun. Untuk kontrol digunakan air steril. Setelah itu diinkubasikan selama 24 jam dan kemudian diamati gejala kematian jaringan (bercak nekrosis) pada tempat infiltrasi suspensi bakteri. Uji Hipersensitif positif jika pada tempat infiltrasi tersebut terdapat gejala nekrotik dan uji Hipersensitif negatif jika pada tempat infiltrasi tidak terdapat kematian jaringan.

 HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Cabe (Capsicum annum var longum) merupakan salah satu komoditas hortikultura yang memiliki nilai ekonomi penting di Indonesia. Cabe merupakan tanaman perdu dari famili terong-terongan yang memiliki nama ilmiah Capsicum sp. Secara umum cabe memiliki banyak kandungan gizi dan vitamin, diantaranya kalori, protein, lemak, karbohidrat, kalsium, vitamin A, B1 dan vitamin C. Pada umumnya kandungan gizi tersebut merupakan salah satu nutrisi yang dibutuhkan cendawan amaupun bakteri. Oleh karena itu tanaman dapat terserang oleh patogen-patogen berupa cendawan maupun bakteri. Tidak lain hal pada bagian-bagian tertentu tanaman, seperti benih, daun, batang, perakaran, bahkan tunas. Pada praktikum ini ditelaah mengenai deteksi patogen benih pada tanaman cabe keriting (Capsicum annum) yang menyebabkan tidak tumbuhnya benih atau penyebab mati tanaman.

Berdasarkan hasil pengamatan (Tabel 1.), terdeteksi adanya bakteri pada suspensi benih yang di inkubasikan. Bakteri tersebut terdeteksi pada medium PDA yang memiliki berbagai macam bentuk koloni dan warna. Namun, setelah di infiltrasikan ke daun tembakau, tidak menunjukkan adanya gejala patogenitas terhadap tanaman, terutama pada bagian infiltrasi pada daun. Salah satu uji syarat utama bakteri untuk dijadikan sebagai agensi biokontrol adalah tidak menimbulkan pengaruh negatif atau fitotoksitas. Uji hipersensitif ini menggunakan daun tanaman tembakau karena tanaman ini merupakan tanaman model yang telah diketahui secara lengkap sekuen gennya termasuk gen yang menyandikan resistensi tanaman, juga ruang di antara pembuluh daunnya lebar sehingga relatif mudah untuk menginfiltrasikan suspensi isolat. Isolat yang menghasilkan reaksi hipersensitif positif berarti bersifat patogenik. Sehingga tidak dapat digunakan sebagai agens biokontrol. Uji hipersensitif ini selain untuk mengetahui bakteri sebagai agensi biokontrol dan bersifat virulen, yaitu sebagai uji aktivitas produksi senyawa anti bakteri oleh tanaman model.

Tabel 1. Hasil uji hipersesitif pada tanaman tembakau

Koloni awal	Hasil uji hipersensitif
Putih Gerigi	0
Putih Bulat I	0
Putih	0
Putih Kekuningan	0
Putih Bulat II	0
Putih Bergaris	0

Uji patogenisitas bertujuan untuk melihat apakah hasil isolasi bakteri menunjukkan gejala penyakit yang khas saat diinokulasikan pada tanaman inang atau tidak. Reaksi hipersensitif meliputi hilangnya permeabilitas membran sel, meningkatnya respirasi, akumulasi dan oksidasi senyawa fenol dan pembentukan senyawa fitoaleksin. Pada infeksi daun oleh bakteri, reaksi hipersensitif menyebabkan hancurnya semua membran seluler dari sel yang kontak dengan bakteri, dan kemudian diikuti dengan pengeringan dan nekrosis jaringan daun yang terserang bakteri tersebut. Berdasarkan hasil pengamatan pada tabel 1., bakteri yang terdeteksi dapat dikatakan tidak lain adalah bakteri yang tidak bersifat patogen dan dapat pula dikatakn sebagai bakteri yang ersifat patogen.

Untuk pernyataan yang pertama, disebabkan karena setelah dilakukan infiltrasi ke tanaman tembakau melalui daun, tidak menunjukkan adanya gejala patogenitas, melainkan tanaman tumbuh menjadi subur. Jika dilihat berdasarkan pernyataan yang kedua, besar kemungkinan tanaman tembakau yang diinfiltrasikan suspensi bakteri hasil pengenceran 10^-3, 10^-4, dan 10^-5 telah menghasilkan senyawa antibakteri yang menyebabkan bakteri tidak bersifat patogen, melainkan bakteri mengalami kematian. Dari kedua pernyataan tersebut belum dapat ditentukan mana yang lebih akurat pernyataannya. Hal ini dapat dijadikan suatu pembahasan lebih lanjut dalam hal pendeteksian bakteri menggunakan uji perlakuan lainnya. Kemungkinan tidak terjadinya gejala nekrotik pada sebagian tanaman indikator tersebut dapat juga disebabkan masa inkubasi yang kurang lama jadi gejala yang diinginkan belum terbentuk, atau pertumbuhan bakteri telah terhambat atau terhenti pada pengenceran 10^-3 atau pengenceran lainnya.  

KESIMPULAN

1. Dari isolasi hasil pengenceran suspensi bakteri diketahui adanya bakteri pada benih cabe keriting sachet yang diperoleh dari toko pertanian.
2. Uji Hipersensitivitas dilakukan untuk mengetahui sifat patogenitas bakteri yang terdeteksi dari metode pengenceran. Hasil uji hipersensitif menunjukkan bahwa bakteri yang terdeteksi pada benih bukan merupakan bakteri yang patogenik pada tanaman.

Download file .doc

DAFTAR PUSTAKA

Agrios, G.N. 1996. Ilmu Penyakit Tumbuhan. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. 

Buck, J. D. 1982. Non staining KOH method for determination of gram reaction of marine bacteria. Applied and Environtmental Microbiology 44: 992-993.

Goto, M. 1992. Fundamentals of Bacterial Plant Pathology. Academic Press Inc., California.

Mathur, S. B. and O. Kongsdal. 2003. Common Laboratory Seed Health Testing Methods for Detecting Fungi. ISTA, Copenhagen.

Rahma, H. dan U. Khairul. 2009 . Analisis Keragaman Fisiologis dan Molekular Bakteri Penyebab Layu Stewart: Penyakit Baru Pada Tanaman Jagung di Indonesia dan Pengelolaanya. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Depdiknas. Jurusan Hama dan Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian Universitas Andalas, Padang.

Sundin, G.W., D.H. Demezas and C.L. Bender. 1994. Genetic and plasmid diversity within natural populations of Pseudomonas syringae with various exposures to copper and streptomycin bactericides. Appl. Environ. Microbiol. 60: 4421-4431.